OBJECTIVES: Establecer costos de aplicación de los biológicos contenidos en el Programa Ampliado de Inmunizaciones (PAI) en Colombia, que sirvan en evaluaciones económicas posteriores. METHODS: Se combinaron dos tipos de estudio: microcosteo tipo bottom up de centros vacunadores en municipios, desde la perspectiva del tercer pagador, y una revisión presupuestal de las asignaciones y gastos del PAI año 2009 en las direcciones territoriales de salud. Para lograr representatividad nacional se seleccionaron 62 municipios según nivel de pobreza distribuidos en 5 regiones, elegidos mediante un muertreo probabilístico, estratitifcado,  polietápico. Se recolectó información por tipo de bilógico y por los diferentes elementos del costo. Se realizó análisis de datos con medidas de tendencia central. Los datos fueron recolectados en pesos colombianos (COP) y convertidos a dólares americanos (USD) del 2009.   RESULTS: Los costos de aplicación de vacunas presentan diferencias por tipo de biológico y región. Los mayores costos por dosis aplicada son neumococo (30.21USD) y (30.07USD) polio inyectable (VIP), frente a los más bajos: (3.53USD) polio oral (VOP) y toxoide tetánico (3.81USD). A nivel regional los costos más altos corresponden a los de Orinoquia y Amazonia que son las de mas difícil acceso.  Por categoría de municipios mostró que los biológicos son más costosos en los de mayor pobreza. El recurso humano tiene un peso porcentual del 35.92% del total y del 58% si se excluye el costo de los biológicos. La perdida de biológico significó 6.55% frente al costo, con variaciones según el biológico.   CONCLUSIONS: La mediana del costo total por aplicación de una dosis incluida en el PAI sería de 6.32USD. Si se excluyen los costos de desperdicio y el costo del biológico, la mediana de aplicación sería de 3.92USD. Estos costos están influenciados por el nivel de productividad de los centros y es similar al notificado por estudios internacionales.